D-荧光素钾盐，D-虫荧光素钾盐；D-Luciferin potassium

分子式：C11H7KN2O3S2    分子量：318.41   CAS 号：115144-35-9

一：背景简介：哺乳动物发光，一般是将萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)基因整合到需观察细胞的染色体DNA上，以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达。标记后的荧光素酶只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光强度与标记细胞的数目呈线性相关。除萤火虫荧光素酶外，有时也会用到海肾荧光素酶(renilla luciferase)。二者的底物不同，萤火虫荧光素酶的底物是荧光素(D-luciferin,常见钾盐或者钠盐)。二者的发光波长也不一样，前者发光波长在540-600 nm,后者发光波长在460-540nm。荧光素所发的光更容易透过组织，在体内代谢较慢，而且特异性好。所以大部分活体成像实验采用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因。

D-荧光素（D-Luciferin）是荧光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍应用于整个生物技术领域，特别是体内活体成像技术。其作用机制是在ATP和荧光素酶的作用下，荧光素（底物）能够被氧化发光。当荧光素过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性（见下图）。将携带荧光素酶编码基因（Luc）的质粒转染入细胞后，导入研究动物如大、小鼠体内，之后注入荧光素，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用ATP对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。

D-荧光素也常用于体外研究，包括荧光素酶和ATP水平分析；报告基因分析；高通量测序和各种污染检测。目前有三种产品形式：D-荧光素（游离酸），D-荧光素盐（钠盐和钾盐）。主要差别在于溶解特性：前者的水溶性以及缓冲体系的溶解性都较弱，除非溶于弱碱如低浓度NaOH和KOH溶液。可溶于甲醇和DMSO；后者能够易溶于水或缓冲液中，使用方便，溶剂无毒性，特别适合体内实验。配成溶液后的这三种产品，在绝大多数的应用上都没有实质性的差别。  根据文献及客户使用习惯，目前使用荧光素钾盐的较为常见。

美仑自主研发的D-荧光素钾盐，具有纯度高，溶解性好，发光强度高衰减慢等特点，媲美进口产品。目前已经实现批量化生产，批产量高达100克以上。

产品用途：D-Luciferin作为荧光素酶的底物，存在于多种发光生物体中。在ATP和荧光素酶的催化作用下，荧光素被氧化，产生蓝绿色的光(560nm)，当底物过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关。编码荧光素酶的Luc基因是植物、细菌、哺乳动物细胞的常见报告基因。由于没有背景干扰，因此可以很容易检测出低至0.02 pg水平的荧光素酶。广泛应用与活体成像报告基因检测等领域。

 

二：meilunstar D荧光素钾产品技术指标及操作方法

技术指标

中文名（Chinese synonym）	D-荧光素钾盐；D-虫荧光素钾盐
英文名（English synonym）	D-Luciferinpotassium,D-Luciferin firefly, potassium salt
CAS号（CAS NO.）	115144-35-9
分子式（Formula）	C11H7N2O3S2 K
分子量（Molecular weight）	318.41 g/mol
外观（Appearance）	淡黄色粉末
溶解性（Solubility）	易溶于水（30 mg/mL）
纯度（Purity）（HPLC）	≥98%
储存条件：	避光-20℃储存
运输条件：	2-8度

操作方法

体外生物发光试验荧光素试剂的制备
材料
—D-荧光素，钾盐（D-luciferin，potassium salt ，MB1834）
—无菌纯水(美仑货号MA0028)
—完全培养基（自行配置）
步骤
1. 用无菌水制备100X荧光素原液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。
2. 将D-luciferin，potassium salt 溶解于预热好的组织培养基中制备成浓度为150 μg/ml的工作液。用组织培养基1∶100稀释储存液，配置工作液(终浓度150μg/mL)。
3. 去除培养细胞的培养基。
4. 图像分析前，向细胞培养板中添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析。
—注射器滤膜过滤除菌，0.2 μ m
*提示：成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。

 

活体成像分析
材料 
—D-荧光素，钾盐（D-luciferin，potassium salt ，MB1834）
—D-PBS,不含钙、镁（细胞培养级）(美仑货号MA0010)
1：配制溶液

使用无菌D-PBS（w/o Ca2+ ;Mg2+）配制D-荧光素钾盐溶液（15mg/ml），0.22µm滤膜过滤除菌（避光），分装后于-20℃或-80℃冷冻保存，避免反复冻融。使用时4℃融化，实验前平衡至室温（避光） 

2：注射量取决于注射方式，具体如下：

注射方式	剂量
静脉注射（25-27gauge针头）	按10µl/g体重浓度，加入相应体积的15mg/ml荧光素工作液
腹腔注射（25-27gauge针头）	按10µl /g体重浓度，加入相应体积的15mg/ml荧光素工作液
肌肉注射（27gauge针头）	50µl，浓度为1-2mg/ml荧光素工作液
鼻内注射（pipette）	50µl，浓度为3mg/ml荧光素工作液

3： 注射入体内10-20 min（待光信号达到最强稳定平台期），再进行成像分析。
注意：建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期。保存和操作的过程中都要避光。另外水溶性储存液过滤除菌后，可以-20℃或-80℃分装冻存，避免反复冻融。如果有条件，对储存液充氮气或氩气（防止氧化），稳定性和保存时间更长，长达1年。 注射方式，动物类型以及体重等都会影响信号的发射，因此建议每次实验都要做荧光素酶动力学曲线，确定最佳信号平台期和最佳的检测时间。荧光素钾盐和荧光素钠盐应用上没有差别，两者的差别在于物理性状上如外形和溶解性。钠盐的水溶性高于钾盐。从目前发表的文献来看，钾盐的使用率远高于钠盐，尤其是体内实验。两者功效相同。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

三：产品测试结果展示及文献发表

 

1 结构确定（HNMR核磁氢谱）

H-NMR谱图，由以上谱图可以看出，美仑产品结构正确。

2 纯度检测（HPLC高效液相）

 

HPLC谱图，由以上谱图可以看出，美仑产品纯度非常高。

3 荧光强度验证

 

采用美国BioTek HTX多功能荧光酶标仪，对meilunstar D荧光素钾盐进行验证，对照产品为进口P公司。双盲对照，结果显示，俩者在荧光强度及动力学指标上无显著差异

图A：D-LuciferinK萤光信号强度检测

 

图B： D-LuciferinK萤光信号稳定性（动力学）检测。等量的萤火虫萤光素酶，分别加入含有300μg/ml D-LuciferinK 的经典萤火虫萤光素酶发光缓冲溶液（含 ATP、CoA、Mg2+ ），从反应初始时刻持续追踪萤光信号60s，可以发现meilunstar D-LuciferinK的萤光信号强度与信号稳定性均与进口公司无显著差别。（仪器：BioTek HTX） 

4 溶解性测试

 

室温条件下，用纯水作为溶剂 测试溶解性，30MG/ML浓度，易溶解，澄清度良好。

5 活体成像实例。

 

6 细胞实验D-荧光素钾盐体外生物发光试验

材料：

—D-荧光素钾盐（D-luciferin potassium salt，美仑货号MB1834）
—无菌纯水（美仑货号MA0028）
—完全培养基（自行配制）

步骤：
1. 贴壁细胞：将细胞接种于培养板中孵育数小时或过夜，使细胞贴壁。悬浮细胞：可以将细胞接种于培养板后直接进行后续操作，无需孵育。如果倍增时间相对较短，则应考虑倍增时间进行细胞计数。

2.将15mg荧光素钾盐溶解于1ml无菌水中，制备成100X荧光素储备液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素钾盐完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。

3. 用预热好的细胞培养基1∶100稀释100X荧光素储备液（15mg/ml），配制成荧光素工作液（终浓度150μg/ml），即配即用。

4. 去除培养板中的培养基。

5. 在成像前，将适量荧光素工作液加入细胞中，然后进行图像分析。注意：成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。孵育时间取决于特定的细胞类型。一般来说孵育10分钟就足够了，根据需要进行测试和调整。

6. 每隔10分钟，最多40分钟，使用VILBER FUSION FX成像系统检查体外生物发光，确定动力学曲线并找出细胞的峰值成像时间点。

 

结果：（见下图A）

 

图A：D-luciferin体外生物发光动力学曲线。使用美仑D-luciferin检测转染pML-NFκB-Fluc2-Neo质粒（美仑货号MA0504）后的293T细胞，VILBER FUSION FX成像系统下每5min检测萤光信号一次，持续追踪40min。动力学曲线显示，美仑D-luciferin作为底物的细胞生物发光衰减较慢，40min后萤光信号强度仅衰减25%左右。

 

7 近期使用meilunstar D荧光素钾盐发表文献举例

 

(1). Development of a hypoxia-triggered and hypoxic radiosensitized liposome as a doxorubicin carrier to promote synergetic chemo-/radio-therapy for glioma

期刊：BIOMATERIALS 影响因子：10.273

(2)Hypoxia-responsive lipid-poly-(hypoxic radiosensitized polyprodrug) nanoparticles for glioma chemo- and radiotherapy. 

期刊：Theranostics；影响因子：8.06

(3)Theranostic size-reducible and no donor conjugated gold nanocluster fabricated hyaluronic acid nanoparticle with optimal size for combinational treatment of breast cancer and lung metastasis

期刊：JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE  影响因子：7.901

(4)Hypoxia-responsive ionizable liposome delivery siRNA for glioma therapy.  

 期刊：International Journal of Nanomedicine  影响因子：4.47

(5)Self-assembled angiopep-2 modified lipid-poly (hypoxic radiosensitized polyprodrug) nanoparticles delivery TMZ for glioma synergistic TMZ and RT therapy

期刊：DRUG DELIVERY  影响因子：3.829

(6)Angiopep-2 Modified Cationic Lipid-Poly-Lactic-Co-Glycolic Acid Delivery Temozolomide and DNA Repair Inhibitor Dbait to Achieve Synergetic Chemo-Radiotherapy Against Glioma

 期刊：JOURNAL OF NANOSCIENCE AND NANOTECHNOLOGY  影响因子：1.093